一、Ct值是什么？
qPCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)的所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold）。C為Cycle，T為Threshold。簡(jiǎn)單講，Ct值就是qPCR中起始模板擴(kuò)增達(dá)到相對(duì)的產(chǎn)物量時(shí)，所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。
二、為什么要有Ct值？
1、模板量與Ct值的關(guān)系：
在PCR指數(shù)擴(kuò)增過(guò)程當(dāng)中，產(chǎn)物量與循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個(gè)數(shù)。
2、Ct值的設(shè)定：
qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物量是以熒光信號(hào)的形式直接呈現(xiàn)，也就是擴(kuò)增曲線。在擴(kuò)增過(guò)程當(dāng)中，設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)值，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到“產(chǎn)物量”時(shí)（即達(dá)到此熒光閾值時(shí)），此時(shí)循環(huán)數(shù)定義為Ct值，需要注意的是，Ct值需要處于指數(shù)擴(kuò)增時(shí)期。因此Ct值與起始模板量的關(guān)系：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。
3、Ct值的重現(xiàn)性
Ct值是熒光定量PCR很重要的結(jié)果呈現(xiàn)形式，用于基因表達(dá)量差異或基因拷貝數(shù)的結(jié)果計(jì)算。一般情況下，復(fù)孔Ct值的差值不能大于0.05，不然表明誤差結(jié)果太大，結(jié)果不可信。在PCR早期，擴(kuò)增處于理想情況下，循環(huán)數(shù)較少，產(chǎn)物積累少，產(chǎn)生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯的區(qū)別；之后熒光的產(chǎn)生增加進(jìn)入指數(shù)期，此時(shí)微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
三、Ct值的范圍與影響因素？
1、擴(kuò)增效率En
PCR擴(kuò)增效率是指聚合酶把待擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)變生成擴(kuò)增子的效率。由1個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)變生成2個(gè)DNA分子時(shí)的擴(kuò)增效率為99.9%。擴(kuò)增效率常用En表示。En是一個(gè)非常重要的參數(shù)，Ct值可不可信，需要評(píng)估En是否正常，En的正常范圍為90%-110%之間，影響En的因素有很多，常見(jiàn)的因素如下表：
2、Ct值的范圍
Ct值的范圍為15-35。但是一般建議對(duì)于不同的基因Ct范圍，因起始模板量中基因拷貝數(shù)和擴(kuò)增效率不同，需做出該基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出基因的線性檢測(cè)范圍以及En。
3、Ct值異常的原因與解決方案
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