咨詢熱線：4009097985

一、WB實(shí)驗(yàn)介紹

“Western Blot

WB（Western Blot，蛋白免疫印跡）是一種常規(guī)的蛋白分析技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

WB實(shí)驗(yàn)的基本核心理念是抗原抗體的特異性反應(yīng)，通過變性膠 SDS-PAGE 將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開，然后轉(zhuǎn)移到固相載體 PVDF 膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進(jìn)行封閉和一抗稀釋液進(jìn)行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結(jié)合后，用 TBST 洗脫液洗脫掉多余未結(jié)合的一抗，加入帶有 HRP 標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，這樣，我們的蛋白+一抗+二抗形成一個(gè)復(fù)合物，加以化學(xué)發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會(huì)產(chǎn)生熒光，利用膠片或者化學(xué)發(fā)光儀就可以顯現(xiàn)靶蛋白的條帶顯現(xiàn)。

WB常規(guī)實(shí)驗(yàn)流程：蛋白提取→蛋白定量→制膠→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育→一抗洗脫→二抗孵育→二抗洗脫→化學(xué)發(fā)光→數(shù)據(jù)分析。

二、WB實(shí)驗(yàn)試劑配置

在實(shí)驗(yàn)開始之前，可以按以下配方比例配置實(shí)驗(yàn)所需試劑。

1

電泳緩沖液

取電泳緩沖液干粉（G2018-1L），溶解于 1L純水（G4701-500ML）中，置于磁力攪拌器（MS-150）上攪拌充分溶解。

2

轉(zhuǎn)膜緩沖液

取轉(zhuǎn)膜緩沖液干粉（G2017-1L），溶解于 800mL 純水中，加入 200mL 的甲醇，置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

3

TBST 緩沖液

取TBS 粉劑（G0001-2L），溶解于 2L 純水中，加入 1mL 吐溫20，置于磁力攪拌器上攪拌充分溶解。

4

5%脫脂牛奶

稱量 5g脫脂奶粉（G5002-100G），溶解于 100mLTBST 溶液（G0004-500ML）中，置于磁力攪拌器上攪拌至少 30分鐘，然后放入 4℃冰箱暫放。

5

完全裂解液

1mLRIPA 裂解液（G2002-100ML或G2033-100ML）+20μLcocktail（G2006-250UL）+10μL磷酸化蛋白酶抑制劑 A（G2007-1ML）+10μL磷酸化蛋白酶抑制劑 B（G2007-1ML）+10μLPMSF（G2008-1ML），除 RIPA 外，其他四種試劑使用前幾分鐘加入，現(xiàn)配現(xiàn)用。

三、WB實(shí)驗(yàn)步驟

由于文章篇幅限制，小賽這次先介紹組織或細(xì)胞的蛋白提取和蛋白定量常規(guī)流程。

蛋白提取

1 組織總蛋白提取

準(zhǔn)備好所需要數(shù)量的樣本管；放入研磨珠，置于冰盒上備用；

組織塊先用預(yù)冷PBS洗滌 2-3 次，除去血污，然后放在濾紙上，吸盡多余的 PBS 后放入對(duì)應(yīng)的勻漿管中，加入大約 10 倍樣本體積的完全裂解液，置于組織研磨儀（三維冷凍研磨儀KZ-5F-3D）中，對(duì)稱放置，確認(rèn)放置平衡后，蓋好蓋子，選擇程序開始勻漿。

Servicebio研磨儀

Tips

①　芝麻大小的組織，一般加入100-200μL 完全裂解液；綠豆大小組織加入 400-600μL 完全裂解液；黃豆大小組織加入 800-1000μL完全裂解液。

②　Servicebio三維研磨儀參考參數(shù)：2mm 氧化鋯珠8-12顆，頻率6.5m/s，時(shí)間30s。如果一次勻漿不徹底，可以再次勻漿）。如果組織塊比較大，可提前用剪刀將組織塊剪碎。

2 懸浮細(xì)胞提取蛋白

將細(xì)胞連帶培養(yǎng)基一起吸入15mL 離心管（EP-1501-J）中，4℃，2000rpm，離心 5分鐘，去掉上清；

加入 1mLPBS 溶液（G4202-500ML）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5mL 離心管（EP-150-M）中，然后 4℃，2000rpm，離心 5分鐘，去掉上清，保留沉淀，重復(fù)此步驟 2-3 次（此步驟目的為清洗細(xì)胞中殘留的培養(yǎng)基）；

根據(jù)細(xì)胞沉淀的量加入適量的完全裂解液，例如沉淀體積為綠豆大?。ù蟾?10uL 左右）的加入大約 200μL 完全裂解液，加入適量研磨珠，放入研磨儀進(jìn)行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，離心 10分鐘，上清即為總蛋白溶液。

3 貼壁細(xì)胞提取蛋白

倒掉培養(yǎng)基，沿細(xì)胞培養(yǎng)皿側(cè)壁或者培養(yǎng)瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液，輕輕晃動(dòng)平皿或者培養(yǎng)瓶，然后將細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶?jī)A斜放置，用移液槍輕輕吸除殘余液體，盡量輕柔，不要將細(xì)胞沖掉，清洗 2-3 次，最后一次將殘余 PBS 完全吸干；

加入適當(dāng)體積的完全裂解液（例如六孔板各單孔細(xì)胞長(zhǎng)滿的話，加入大約 250μL完全裂解液），反復(fù)晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶，讓裂解液與細(xì)胞完全接觸，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來，收集后，加入研磨珠，放入研磨儀中進(jìn)行裂解；

裂解完成后，12000rpm，4℃，離心 10分鐘，上清即為總蛋白溶液。

蛋白定量

取適量上述步驟中未變性的總蛋白溶液，用BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（G2026-200T；G2026-1000T）測(cè)蛋白濃度，蛋白濃度測(cè)定方法如下：配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液

取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長(zhǎng)期保存。

配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液

取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準(zhǔn)確。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）

將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

準(zhǔn)備待測(cè)樣品

將待測(cè)的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測(cè)結(jié)果可信），按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中。待測(cè)樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。

配制BCA顯色工作液

將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個(gè)待測(cè)樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費(fèi)。

檢測(cè)

向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測(cè)樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)做參比，在562 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)）

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測(cè)樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品實(shí)際蛋白濃度。