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  流式細(xì)胞術(shù)目前主要用于檢測樣本中所發(fā)出的熒光強度，分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達水平，從多樣性的細(xì)胞群中分辨及界定不同細(xì)胞種類，測定分離出的細(xì)胞亞群純度，以及分析細(xì)胞的大小和總量。它可以同時分析單個細(xì)胞的多個參數(shù)。

原理

正?；罴?xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）僅分布于細(xì)胞磷脂雙分子層內(nèi)側(cè)，凋亡早期，磷脂酰絲氨酸（PS）由細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè)，可作為凋亡細(xì)胞表面的特異性標(biāo)記靶標(biāo)。

而廣泛存在于真核細(xì)胞胞漿內(nèi)的一種 Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白——Annexin V（一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，分子量為 35-36KDa）,可特異性高親和結(jié)合磷脂酰絲氨酸（PS），熒光標(biāo)記的 Annexin V仍可與磷脂酰絲氨酸（PS）高親和結(jié)合，作為特異性熒光探針用于標(biāo)記凋亡早期的細(xì)胞。      

有研究發(fā)現(xiàn)核酸熒光染料碘化丙啶 (Propidium lodied,PI)，不能透過正?；罴?xì)胞和凋亡早期具有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，但可穿透細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞（如壞死或凋亡晚期的細(xì)胞），嵌入雙鏈 DNA，水溶液中，與 DNA 結(jié)合的該染料最大激發(fā)/發(fā)射波長為 535/617 nm。

利用該特性，通常與熒光標(biāo)記的 Annexin V——FITC-Annexin V 結(jié)合利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡對凋亡細(xì)胞進行分群。

另外，紅色核酸染料 7-AAD 也可穿透細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞，與熒光標(biāo)記的 Annexin V——PE-Annexin V 結(jié)合利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡對凋亡細(xì)胞進行分群。

用途

1、精確反應(yīng)細(xì)胞群體的凋亡趨勢；

2、對細(xì)胞中凋亡細(xì)胞進行分群和定量；

3、對凋亡細(xì)胞進行分群和定量

材料與儀器

1、孵育緩沖液：10 mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2

2、標(biāo)記液：將FITC- Annexin V 和PI加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1ug/ml

3、流式細(xì)胞儀

步驟

1、細(xì)胞收集：懸浮或貼壁細(xì)胞（無 EDTA 胰酶消化）收集到離心管中，300-500 g 離心5 min，棄去培養(yǎng)液；

2、用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，300-400 g，2-8℃，離心 5 min收集細(xì)胞；

3、按不同試劑公司說明取相應(yīng)量的熒光染料標(biāo)記結(jié)合溶液重懸細(xì)胞，濃度大約為（1~5）×106/mL；

4、按不同試劑公司說明向100 μL 細(xì)胞混懸液中加入適量的熒光標(biāo)記的Annexin V染料，輕輕混勻后室溫或 2-8℃ 避光條件下孵育5-15 min;

5、按不同試劑公司說明加入適量的核酸染料，輕輕混勻后室溫或 2-8℃ 避光條件下孵育1-5 min;

6、加入 400μL PBS，輕輕混勻;

7、細(xì)胞過 200 目篩網(wǎng)后流式細(xì)胞儀檢測;

結(jié)果說明：FITC-Annexin V/PE-Annexin V(-) PI/7-AAD(-)——活細(xì)胞；

FITC-Annexin V/PE-Annexin V(+) PI/7-AAD(-)——早期凋亡細(xì)胞;

FITC-Annexin V/PE-Annexin V(+) PI/7-AAD(+)——中晚期凋亡細(xì)胞。

注意事項

1、細(xì)胞處理要小心，盡量減少人為損傷，離心力在不損失細(xì)胞的情況下盡可能 小，重懸細(xì)胞要小心，避免多次吹打，不要渦旋；

2、熒光染料操作時要低溫、避光；

3、含血小板的血液樣品要去除血小板，因血小板含 PS，可與 Annexin V 結(jié)合干擾實驗結(jié)果；  

4、流式細(xì)胞檢測細(xì)胞量不得小于1×10^5

5、染色完成后過篩的單細(xì)胞懸液要盡快上機檢測，緩沖液中細(xì)胞存活時間不常；    

6、 注意設(shè)置對照：空白對照 單染對照 陽性對照。

常見問題

1、實驗中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡，解決辦法-確切的凋亡誘導(dǎo)劑設(shè)置陽性對照；

2、貼壁細(xì)胞消化不當(dāng)，解決辦法-無 EDTA 胰酶消化，Annexin V 與 PS 的結(jié)合依靠二價鈣離子，EDTA 可螯合鈣離子影響結(jié)合進而影響染色。