咨詢熱線：4009097985

一、細(xì)胞增殖

1.細(xì)胞增殖的定義

細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。單細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的個(gè)體。多細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的細(xì) 胞，用來(lái)補(bǔ)充體內(nèi)衰老或死亡的細(xì)胞。

2.細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法

① 細(xì)胞代謝活性檢測(cè)

（基于MTT、CCK-8等）

MTT（噻唑藍(lán)）：通過(guò)添加四咪唑鹽到細(xì)胞中可進(jìn)行線粒體內(nèi)酶代謝活性的測(cè)定?；罴?xì)胞能將四咪唑鹽（如MTT、XTT、WST-1）還原成藍(lán)紫色的甲瓚或甲瓚鹽（Formazan），可通過(guò)分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

Cell Counting Kit–8 （CCK-8）中的WST-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng) 基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。基于CCK-8（WST-8）的試劑盒能高度準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞增殖，比MTT法 及XTT法的靈敏度高5倍，能檢測(cè)更低的細(xì)胞數(shù)目。該試劑盒可適用于96孔板培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞。

② DNA的合成的檢測(cè)

二.細(xì)胞自噬（Autophagy）

1、細(xì)胞自噬的定義

自噬（Autophagy）是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種高度保守的代謝過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食（Self-eating）”現(xiàn)象。它作為細(xì)胞內(nèi)的主要降解途徑，將胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)降解。

它主要有三 種形式：大自噬，小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。

細(xì)胞自噬檢測(cè)方法

① 自噬標(biāo)志物（ LC3）檢測(cè)

自噬形成時(shí)，胞漿型 LC3（即 LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即 LC3-II），LC3-II/I 比值的大小可 估計(jì)自噬水平的高低。LC3 這一轉(zhuǎn)變過(guò)程可被 Western Blot 和熒光顯微鏡檢測(cè)到，現(xiàn)已成為監(jiān)測(cè)自噬體形成的推薦方法。在哺 乳動(dòng)物中，LC3 包含 3 種亞型：LC3A、LC3B、LC3C，分布在不同的組織中，因此需要用不同的抗體去鑒定這3種亞型。

② GFP-LC3 單熒光自噬指示體系

利用 LC3 在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象構(gòu)建了 GFP-LC3 指示體系，無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成 時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通 過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

③ mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系

mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒產(chǎn)品 mRFP 用于標(biāo)記及追蹤 LC3，GFP 的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體。 由于 GFP 熒光蛋白對(duì)酸性敏感(pH 敏感)，當(dāng)自噬體與溶酶體融合后 GFP 熒光發(fā)生淬滅,而 mRFP 相對(duì)穩(wěn)定，因此只能檢測(cè)到紅色熒光。

要點(diǎn)：細(xì)胞凋亡、自噬和壞死的區(qū)別

凋亡：細(xì)胞皺縮、體積縮?。徊糠旨?xì)胞器、核糖體和核碎片被細(xì)胞膜包裹形成 凋亡小體，從細(xì)胞表面出芽脫落，最 后被具有吞噬功能的細(xì)胞吞噬；磷脂酰絲 氨酸外翻；細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化、染色質(zhì)DNA斷裂。

自噬：部分細(xì)胞器腫大，在細(xì)胞質(zhì)中形成包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的雙層膜囊泡結(jié)構(gòu) ，再與溶酶體結(jié)合實(shí)現(xiàn)內(nèi)容物的降解。

壞死：細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分 ，引起局部嚴(yán)重的炎癥。

三、細(xì)胞遷移和侵襲

1、細(xì)胞遷移和侵襲的定義

①侵襲：腫瘤細(xì)胞向器官表面靠攏→腫瘤細(xì)胞用偽足貼在表面與內(nèi)皮細(xì)胞粘連→腫瘤細(xì)胞用偽足從細(xì)胞的天然間隙 到達(dá)基底層→腫瘤細(xì)胞深入器官深部→形成癌巢搜索

②轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)瘤，侵入淋巴管（或血管）→腫瘤細(xì)胞在淋巴管（或血管）內(nèi)運(yùn)行→腫瘤細(xì)胞從管中出 來(lái)，再轉(zhuǎn)移到其他淋巴結(jié)（或毛細(xì)血管）中→到達(dá)其他組織或器官

2、細(xì)胞遷移和侵襲的檢測(cè)方法

① 細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移

細(xì)胞劃痕是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，實(shí)驗(yàn)成本低，可以用來(lái)檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 注意事項(xiàng)：一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，都是在無(wú)血清或者低血清狀態(tài)下培養(yǎng)的，否則細(xì)胞增殖就不能忽略。

按照6孔板背后畫(huà)線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)，這就解決了前后觀察時(shí)位置不固 定的問(wèn)題。

（基于BrdU的免疫法或EdU的點(diǎn)擊化學(xué)法），可通過(guò)體內(nèi)成像、微孔板或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 等多種技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞示蹤。

DNA的新組裝合成是細(xì)胞生長(zhǎng)的必要條件，故經(jīng)常被用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力及凋亡的檢測(cè)。BrdU及EdU，都是胸腺嘧啶的非放射性類(lèi)似物，能摻入增殖細(xì)胞的DNA中，可通過(guò)對(duì)BrdU及EdU的檢測(cè)，從而對(duì)DNA的合 成量進(jìn)行測(cè)定。

EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲 入正在復(fù)制的DNA分子中，通過(guò)基于EdU與Apollo?熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性，適用于細(xì) 胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究，尤其適合進(jìn)行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實(shí)驗(yàn)。

② Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸 酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞， 應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研 究。侵襲實(shí)驗(yàn)需鋪Matrigel，而遷移實(shí)驗(yàn)不需要。